Grazie per aver visitato nature.com.Stai utilizzando una versione del browser con supporto limitato per i CSS.Per ottenere la migliore esperienza, ti consigliamo di utilizzare un browser più aggiornato (o disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili e JavaScript.Carosello con tre diapositive mostrate alla volta.Usa i pulsanti Precedente e Successivo per navigare tra tre diapositive alla volta o i pulsanti con i puntini alla fine per saltare tre diapositive alla volta.Alžběta Dostálková, Romana Hadravová, … Michaela RumlováCynthia Mathew, Sharon Tamir, … Reena GhildyalMohammed Samer Shaban, Christin Müller, … Michael KrachtZhou-Qin Zheng, Su-Yun Wang, … Yan-Yi WangFarzad Fatehi, Richard J. Bingham, … Reidun TwarockJeremy R. Keown, Zihan Zhu, … Jonathan M. GrimesHaitian Fan, Alexander P. Walker, … Ervin FodorRam Kumar, Yogesh Chander, … Naveen KumarFanny Georgi, Fabien Kuttler, … Urs F. GreberNature volume 595, pagine 596–599 (2021) Cita questo articoloI condensati biomolecolari sono emersi come un importante principio organizzativo subcellulare1.La replicazione di molti virus, compreso il virus respiratorio sinciziale umano (RSV), avviene in compartimenti indotti dal virus chiamati corpi di inclusione (IB) o viroplasma2,3.È stato recentemente dimostrato che gli IB dei virus a RNA a filamento negativo sono condensati biomolecolari che si formano attraverso la separazione di fase4,5.Qui riportiamo che l'alcaloide steroideo ciclopamina e il suo analogo chimico A3E inibiscono la replicazione di RSV disorganizzando e indurendo i condensati IB.Le azioni di ciclopamina e A3E sono state bloccate da una mutazione puntiforme nel fattore di trascrizione RSV M2-1.La disorganizzazione degli IB si è verificata in pochi minuti, il che suggerisce che queste molecole agiscano direttamente sulle proprietà liquide degli IB.L'A3E e la ciclopamina inibiscono l'RSV nei polmoni dei topi infetti e sono piccole molecole simili a farmaci mirate al condensato che hanno attività in vivo.I nostri dati mostrano che i farmaci che induriscono la condensa possono consentire la modulazione farmacologica non solo di molti bersagli precedentemente non drogabili nella replicazione virale, ma anche di fattori di trascrizione nei super-potenziatori che guidano il cancro6.L'RSV è una delle principali cause di malattie respiratorie nei bambini piccoli, negli anziani e negli individui immunocompromessi in tutto il mondo7,8.Attualmente, vengono perseguiti molteplici obiettivi per lo sviluppo di una terapia sicura ed efficace per il trattamento delle infezioni da RSV9.Nelle cellule infette, RSV induce la formazione di IB citoplasmatici, in cui sono concentrati la nucleoproteina (N), la fosfoproteina (P), la polimerasi L, il fattore di trascrizione M2-1 e l'RNA genomico virale.Abbiamo recentemente dimostrato che gli IB sono 'fabbriche virali' in cui avviene la sintesi dell'RNA virale3.La morfologia degli IB suggerisce che siano condensati formati dalla separazione di fase liquido-liquido (LLPS).Uno studio recente ha mostrato che N e P erano sufficienti per guidare la formazione di condensati pseudo-IB attraverso LLPS in vitro, sia nelle cellule che nei saggi biochimici10.Tuttavia, questi condensati pseudo-IB N-P non sono funzionali, poiché non proteggono la sintesi dell'RNA e non riflettono la complessità degli IB nelle cellule infette da virus, che hanno più compartimenti.Sorprendentemente simili per dimensioni e organizzazione delle fasi al nucleolo condensato11, gli IB RSV sono multifasici e contengono un sub-compartimento chiamato granulo associato all'IB (IBAG), che è composto da mRNA virale di nuova sintesi e M2-13,12.I condensati sono emersi come un importante principio organizzativo subcellulare1.Una domanda importante nello sviluppo di farmaci antivirali, e più in generale nella chimica farmaceutica, è se questi condensati siano drogabili.In linea di principio, un farmaco che si dissolve o si indurisce impedisce la replicazione virale.Nessuno dei due meccanismi è stato ancora segnalato.In precedenza abbiamo identificato la ciclopamina (CPM) antagonista della via del riccio (HH) come un potente inibitore della replicazione di RSV13.L'inibizione della segnalazione Sonic hedgehog (SHH) è una caratteristica indesiderata del CPM come inibitore di RSV.Sulla base del modello di legame del complesso binario del ligando del recettore Smoothened (SMO)-CPM14 (Protein Data Bank (PDB) 4O9R) e dei dati sugli analoghi chimici con legame SMO potenziato e attività di antagonismo di segnalazione HH15, abbiamo progettato analoghi CPM con un modificato A-ring (Extended Data Fig. 1) per ingegnerizzare l'attività di segnalazione HH inibitoria.Il gruppo A-ring 3′-idrossile è stato sostituito con gruppi metossi (A3M), etossi (A3E) e propossi (A3P), che mostrano tutti una segnalazione mediata da SHH notevolmente ridotta (Fig. 1a e Dati estesi Fig. 2).La modifica dell'anello 3 'in A3E e A3P ha comportato una perdita quasi completa dell'attività HH (concentrazione inibitoria semimassimale (IC50)> 20 μM nei saggi reporter SHH).A3E è più potente contro RSV in vitro di A3P (A3E, IC50 = 1,0 ± 0,34 μM; A3P, IC50 = 3 ± 1 μM) (dati estesi Fig. 2b, d, f) ed è stato selezionato per tutti gli ulteriori studi.Oltre ai ceppi di riferimento di RSV, A3E e CPM inibiscono anche ceppi di RSV con esperienza di laboratorio minima (Extended Data Fig. 3).Sebbene l'indice di selettività di A3E fosse inferiore rispetto al CPM, era costantemente superiore a 10. Studi futuri dovranno identificare se è possibile apportare modifiche chimiche all'impalcatura CPM che elimini il legame SMO e la segnalazione HH mantenendo o addirittura migliorando l'attività RSV.Da notare che il meccanismo di inibizione di RSV rimane probabilmente invariato poiché lo stesso della sostituzione R151K in M2-1 conferisce resistenza sia ad A3E che a CPM (Fig. 1a).a, La potenza di A3E e CPM è stata determinata utilizzando cellule HEp-2 infette da RSV-Luc- e RSV-M2-1 (R151K)-Luc e cellule NIH3T3 che esprimono luciferasi-reporter Gli-dipendenti indotte da SHH.I risultati sono espressi come media ± sd per un rappresentante di tre esperimenti indipendenti eseguiti in triplice copia.Sono indicate le concentrazioni di IC50 in μM.b, cellule HEp-2 infette da RSV-M2-1-mGFP trattate con A3E o CPM per 1 ora (vedere Dati estesi Fig. 4).Vengono mostrate immagini rappresentative di quattro esperimenti indipendenti.Il poli(A) RNA è mostrato in rosso e i nuclei sono mostrati in blu.Barra della scala, 10 μm.Le frecce bianche indicano gli IB.La formazione di IBAG all'interno delle fabbriche virali di RSV dipende dalla sintesi de novo dell'mRNA virale, che recluta M2-1 e che è stato proposto derivare dalla separazione di fase3.Abbiamo utilizzato un RSV ricombinante che esprime una proteina di fusione M2-1-mGFP funzionale per analizzare l'effetto di A3E e CPM sulla localizzazione subcellulare di M2-1.Nelle cellule non trattate, M2-1 distribuito in modo omogeneo nel citoplasma e concentrato negli IBAG come rivelato dalla colorazione FISH (fluorescenza in situ) poli (A) -RNA (Fig. 1b e Dati estesi Fig. 4).Al contrario, gli IBAG non erano più visibili nelle cellule trattate con composto e M2-1-mGFP insieme all'RNA poli (A) è stato rilevato in tutto l'IB.La perdita completa dell'organizzazione di IB e IBAG è stata osservata dopo un trattamento di 1 ora con composti a una concentrazione equivalente a 0, 5 × IC90 (dati estesi Fig. 4).L'imaging a fluorescenza time-lapse ha rivelato che la perdita del partizionamento IB e IBAG si è verificata entro pochi minuti dall'aggiunta di A3E e CPM (video supplementari 1–3).Ciò suggerisce che entrambi i composti hanno abolito la separazione di fase tra IB e IBAG che potrebbe essere mediata dai complessi M2-1-mRNA.Abbiamo ipotizzato che le fabbriche virali di RSV siano condensati formati da LLPS10.La natura dinamica degli IB RSV è stata mostrata nelle cellule infette da RSV ricombinante che esprimeva una proteina P fluorescente che aveva un tipico comportamento simile a un liquido che mostrava frequenti eventi di fusione tra IB seguiti da una rapida coalescenza per formare un IB sferico più grande (Fig. 2a e Video supplementare 4 ).Come previsto per i condensati, gli IB si sono disassemblati in seguito a shock osmotico e trattamento con 1,6-esandiolo, che interrompe le interazioni proteina-proteina idrofobica (Fig. 2b, c e Dati estesi Fig. 5a, b).Per confermare ulteriormente la natura liquida degli IB, abbiamo analizzato il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP) degli IB nelle cellule infette da RSV-P-BFP.Abbiamo osservato un pieno e rapido recupero della fluorescenza, che è coerente con la rapida diffusione di P all'interno di IBs.Al contrario, nelle cellule trattate con composti non abbiamo osservato alcuna ridistribuzione di P e recupero della fluorescenza (Fig. 2d, e).Inoltre, gli IB non erano più sensibili allo shock osmotico, hanno perso la capacità di fondersi tra loro e hanno mostrato una leggera diminuzione della mobilità (dati estesi Fig. 5c, d e video supplementari 5-7).Anche la forma degli IB, ma non l'area superficiale, è stata alterata nelle celle trattate con composti, il che ha comportato la parziale perdita della caratteristica forma sferica dei condensati liquidi (Extended Data Fig. 5e).a–g, le cellule HEp-2 sono state infettate per 24 ore con RSV–P–BFP (a–e), RSV–M2-1–mGFP (f) o RSV–M2-1(R151K)–P–BFP (g ) e trattato con 5 μM CPM, 25 μM A3E o DMSO per 1 h.a, Comportamento dinamico di RSV IB.Le punte di freccia indicano un evento di fusione.Le immagini sono rappresentative di dieci video di due esperimenti.Barra della scala, 5 μm.b, c, è stato applicato lo shock ipotonico e le cellule sono state fotografate nei tempi indicati.Le misurazioni etichettate R (recupero) sono state effettuate dopo 5 minuti di shock seguiti da 5 minuti nel mezzo di coltura.b, Il numero medio ± sd di IB per immagine è espresso come percentuale del controllo pre-shock.I dati provengono da dieci acquisizioni in due esperimenti indipendenti.NS, non significativo;***P<0,001;Test di Kruskal – Wallis con test di Dunn a due code per confronti multipli.c, immagini rappresentative.Barra della scala, 10 μm.d – g, l'indurimento di RSV IB di A3E e CPM viene mostrato utilizzando FRAP.È stata registrata la ridistribuzione spontanea della fluorescenza dopo il fotosbiancamento, lo sfondo e lo sbiancamento sono stati corretti durante l'imaging post-sbiancamento e normalizzati al segnale pre-sbiancamento.e, g, I dati provengono da 24 eventi FRAP in due esperimenti indipendenti.d, f, Immagini rappresentative della microscopia time-lapse da esperimenti FRAP sono mostrate per P-BFP (d) e M2-1-mGFP (f).Barre di scala, 2 μm.Le frecce bianche indicano l'area sbiancata.Abbiamo ulteriormente analizzato la mobilità di M2-1 eseguendo FRAP su IBAG in cellule infette da RSV-M2-1-mGFP.Nelle cellule non trattate, le aree fotosbiancate delle strutture IBAG sono state prontamente reintegrate con M2-1-mGFP entro 10 s, rivelando una rapida diffusione di M2-1 negli IBAG e il traffico attivo di M2-1 tra IB e IBAG (Fig. 2f).Tuttavia, nelle cellule infette da RSV-M2-1-mGFP e trattate con A3E o CPM, le proteine ​​​​M2-1 non erano più in grado di ridistribuirsi nell'area fotosbiancata e sono rimaste in uno stato indurito (Fig. 2f).Presi insieme, i nostri dati mostrano che gli RSV IB sono condensati formati da LLPS che possono essere induriti da piccole molecole A3E e CPM.L'indurimento dei condensati IB non comporta la formazione di materiale fibrillare solido poiché non si colorano positivamente con la colorazione tioflavina S16 (Dati estesi Fig. 6a).Abbiamo studiato la permeabilità degli IB induriti analizzando la diffusione di perline di destrano fluorescenti micro-iniettate in cellule infette e trattate17.Le sfere di destrano da 10 kDa, che hanno un raggio idrodinamico (Rh) di 2-3 nm, penetrano completamente negli IB mentre le sfere più grandi da 70 kDa (Rh> 6 nm) sono escluse dagli IB in qualsiasi condizione sperimentale testata (dati estesi Fig. 6b, c).In particolare, le perle di medie dimensioni da 40 kDa (Rh = 4,5 nm) possono entrare nell'IB indurito nelle cellule trattate, il che suggerisce che vi è un aumento della dimensione della maglia IB dopo il trattamento con i composti.Questa scoperta sorprendente merita ulteriori indagini sul meccanismo biofisico dell'indurimento della condensa IB.Abbiamo ingegnerizzato un virus ricombinante RSV-P-BFP che esprime la sostituzione M2-1 (R151K) precedentemente descritta che conferisce resistenza a CPM13 e analizzato le dinamiche e le proprietà dell'IB nelle cellule trattate con composti.Nelle cellule infette da RSV–M2-1(R151K)–P–BFP, il trattamento con CPM o A3E non ha più provocato perdita di rotondità, resistenza allo shock ipotonico o cambiamento nell'organizzazione di IB e IBAG (Extended Data Figs. 7 –9).I dati FRAP mostrano che la mobilità P negli IB non è più influenzata dal trattamento CPM e A3E (Fig. 2g).Presi insieme, questi dati dimostrano che l'effetto antivirale e le proprietà di indurimento della condensa di queste piccole molecole dipendono dalla proteina M2-1.I virus si replicano o si assemblano in focolai in cui le macromolecole virali si concentrano localmente, sebbene molti, come i virus a RNA a filamento positivo, inclusi i coronavirus, non siano noti per formare grandi condensati IB.In particolare, recentemente sono stati segnalati piccoli condensati formati dal nucleocapside di SARS-CoV-218.Se i focolai di replicazione virale più piccoli possano essere induriti e inibiti in un modo simile ai condensati di RSV IB è un'interessante strada per la ricerca futura.A nostra conoscenza, fino ad oggi nessun composto mirato al condensato ha dimostrato efficacia in vivo.Abbiamo quindi analizzato se i composti di indurimento della condensa RSV A3E e CPM fossero in grado di bloccare la replicazione di RSV in un modello murino19.Abbiamo infettato i topi con RSV-Luc e trattato gli animali due volte al giorno con varie dosi di CPM e A3E, a partire dal giorno dell'infezione.Il trattamento di topi con A3E ha provocato un'inibizione significativa e dose-dipendente della replicazione di RSV nei polmoni (Fig. 3a, b).Al culmine dell'infezione virale a 4 giorni dall'infezione (dpi), il segnale luminescente era appena visibile nei polmoni dei topi trattati (Fig. 3a, b e Dati estesi Fig. 10a).Sebbene in genere si possano osservare solo cambiamenti patologici minori nei polmoni dei topi con infezione da RSV-A2, A3E e CPM riducono l'infiammazione e l'esfoliazione dei polmoni degli animali trattati, che sono mostrati come punteggio istopatologico combinato in Fig. 3c.Inoltre, mostriamo che RSV-Luc che esprime la sostituzione della resistenza (R151K) in M2-1 non può essere inibita da nessuno dei due composti in vivo ( P > 0, 05) (Fig. 3a, b), che convalida M2-1 come principale virus proteina bersagliata da A3E e CPM.Presi insieme, questi dati confermano che l'indurimento dei condensati di IB nelle cellule infette in vitro si traduce in efficacia antivirale nei topi con infezione da RSV.L'efficacia dell'A3E nella soppressione della replicazione del virus è simile ma sembra essere leggermente inferiore al CPM, il che potrebbe essere dovuto alla minore potenza dell'A3E osservata in vitro (Fig. 3a, b).Riteniamo che ulteriori indagini utilizzando un modello di malattia di animali di grandi dimensioni dell'infezione da RSV possano chiarire questo problema20.a, b, i topi sono stati infettati da RSV-Luc e trattati due volte al giorno con CPM (n = 12 topi), A3E (5 mg kg-1, n = 8; 15 mg kg-1, n = 12; 30 mg kg- 1, n = 7) o veicolo (n = 27) da 0 a 3 dpi o infetto da RSV–M2-1(R151K)–Luc e trattato con CPM (15mg kg−1, n = 8), A3E (15 mg kg−1, n = 8) o veicolo (n = 13).a, la lettura della bioluminescenza è stata eseguita a 4 dpi e vengono mostrate immagini rappresentative delle viste ventrali di animali infetti.La radianza media è espressa come la somma dei fotoni al secondo da ciascun pixel all'interno della regione di interesse per il numero di pixel (p s−1 cm−2 sr−1).I risultati della bioluminescenza normalizzata sono espressi come media ± sem da almeno due esperimenti.* P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001;Test di Kruskall – Wallis con test di Dunn a due code per confronti multipli.c, Cambiamenti istopatologici nei polmoni di topi infettati dal ceppo RSV A2 e trattati con A3E (15 mg kg-1, n = 6), CPM (15 mg kg-1, n = 3) o veicolo (n = 3).Il virus nel polmone è stato titolato e le sezioni di tessuto sono state preparate come descritto nei Metodi.*P<0,05;ANOVA di Brown-Forsythe e Welch unidirezionale, seguita dai test di Dunn a due code per confronti multipli.Due sezioni polmonari per topo sono state analizzate da tre patologi indipendenti ed è stato calcolato il punteggio medio.I dati sono media ± semI nostri dati in vitro (video supplementari 2, 3) mostrano che A3E e CPM agiscono su RSV IB in pochi minuti.Abbiamo quindi valutato l'efficacia antivirale dei composti indurenti la condensa in un ambiente più realistico confrontando la replicazione di RSV nei topi trattati con A3E e CPM a 1, 2 o 3 dpi, seguita dalla misurazione della luminescenza a 4 dpi (Extended Data Fig. 10b, c ).La riduzione della replicazione del virus può essere osservata quando trattati fino a 2 dpi per entrambi i composti, sebbene non sia stata raggiunta la significatività per l'A3E nei punti di trattamento differiti.Un'azione rapida è una caratteristica prevista di un farmaco che indurisce la condensa ed è stata osservata negli esperimenti di coltura cellulare (video supplementari 1–3).Questo potrebbe essere un importante vantaggio di questa nuova classe di farmaci per le infezioni virali acute che hanno una finestra terapeutica limitata.In effetti, l'RSV provoca una malattia respiratoria acuta caratterizzata da un picco nella replicazione virale nei polmoni21.I pazienti in genere si presentano ai medici diversi giorni dopo l'insorgenza dei sintomi.Dovrebbero essere condotti studi comparativi con inibitori della fase di sviluppo delle proteine ​​RSV F, L e N per determinare la cinetica di inibizione degli attuali inibitori della fase di sviluppo RSV in vitro e in vivo.Qui mostriamo che i condensati formati da una transizione di fase liquido-liquido possono essere induriti da piccole molecole simili a farmaci, con conseguente inibizione della replicazione del virus in vivo.Mirare ai condensati virali potrebbe rivelarsi prezioso per lo sviluppo di farmaci con attività ad ampio spettro contro i futuri patogeni virali emergenti prendendo di mira le proteine ​​​​che sono fondamentali per la formazione di condensa e conservate in tutta la famiglia del virus.I farmaci mirati al condensato possono consentire la modulazione farmacologica di molti bersagli precedentemente non drogabili.Negli ultimi anni, i condensati biomolecolari sono stati infatti dimostrati in vari processi fisiologici come lo sviluppo embrionale, la risposta cellulare allo stress e l'aggregazione proteica patologica nelle malattie neurodegenerative e nel cancro.CPM (Selleck) è stato utilizzato come materiale di partenza basato sulla struttura cristallina del complesso CPM-SMO (PDB 4JKV e PDB 4O9R)14, che mostra le interazioni polari del gruppo A-ring 3′-idrossile con gli amminoacidi nel dominio extracellulare del recettore SMO.Abbiamo progettato analoghi come mostrato in Fig. 1a e Extended Data Fig. 1. Il lavoro di sintesi è stato eseguito presso WuxiAppTec.Ad una soluzione contenente CPM (600 mg, 1,46 mM, 1,0 eq) in metanolo (5 ml), è stato aggiunto Boc2O (382,37 mg, 1,75 mM, 402,49 μl, 1,20 eq).La miscela di reazione è stata agitata a 20°C per 16 ore.La cromatografia su strato sottile (TLC) (etere di petrolio/acetato di etile (PE/EtOAc) = 3/1, fattore di ritenzione (Rf) = 0,45, KMnO4) non ha mostrato materiale di partenza.Il solvente è stato rimosso per ottenere il residuo.Il residuo è stato purificato mediante cromatografia su colonna su gel di silice (PE/EtOAc = 10/1) per dare un composto intermedio (550 mg, 1,07 mM, 73,62% di resa) come solido bianco, denominato CPM-IM-1 (intermedio prodotto 1).Successivamente, a una soluzione di CPM-IM-1 (250 mg, 488,54 μM, 1,0 eq) in THF (4 ml), è stato aggiunto NaH (39,08 mg, 977,08 μM, 60% di purezza, 2,0 eq) a 20 °C.La miscela di reazione è stata agitata a 60°C per 20 min.MeI (346,72 mg, 2,44 mM, 152,07 μl, 5,0 eq) è stato aggiunto alla miscela di reazione e agitato a 60 ° C per 2 ore.TLC (PE/EtOAc = 3/1, Rf = 0,70, KMnO4) non ha mostrato materiale di partenza.La miscela di reazione è stata diluita con acqua (40 ml), estratta con EtOAc (25 ml × 2), lavata con salamoia (30 ml), essiccata su Na2SO4 e concentrata per dare il prodotto grezzo.Il prodotto grezzo è stato purificato mediante cromatografia su colonna su gel di silice (PE/EtOAc = 10/1) per dare il prodotto intermedio 2 (CPM-IM-2; 250 mg, 475,50 μM, 48,67% di resa) come solido bianco.Successivamente, a una soluzione di CPM-IM-2 (150 mg, 285,3 μM, 1,0 eq) e 2,6-lutidina (91,71 mg, 855,90 μM, 99,68 μl, 3,0 eq) in DCM (3,00 ml), TMSOTf (95,12 mg, 427,95 μM, 77,33 μl, 1,50 eq) è stato aggiunto a 0 °C.La miscela di reazione è stata agitata a 0°C per 30 min.TLC (PE/EtOAc = 3/1, Rf = 0,00, KMnO4) non ha mostrato materiale di partenza.La miscela di reazione è stata diluita con NaHCO3 saturo (30 ml), estratta con EtOAc (30 ml × 2), lavata con salamoia (30 ml), essiccata su Na2SO4 e concentrata per dare il prodotto grezzo.Il prodotto grezzo è stato purificato mediante prep-HPLC (NH4HCO3) per dare A3M (13,0 mg, 30,54 μM, resa del 10,70%) come solido bianco.A3E e A3P sono stati sintetizzati con la stessa procedura, mostrata in Extended Data Fig. 1.Le cellule HEp-2 (ATCC, CCL-23) sono state mantenute nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).Il numero ATCC CCL-23 deriva da un contaminante cellulare HeLa ed è raccomandato per la crescita di RSV.Le cellule BSRT7/5 - cellule BHK-21 che esprimono costitutivamente la T7 RNA polimerasi22 - sono state mantenute nel MEM19 di Glasgow.HH-signalling-pathway Le cellule NIH3T3 che esprimono luciferasi-reporter Gli-dipendenti (BPS Bioscience, 60409) sono state mantenute in DMEM.Le cellule sono state coltivate in terreno integrato con siero bovino fetale inattivato al calore al 10% (FBS) integrato con soluzione di penicillina-streptomicina.Inoltre, 0, 5 mg ml-1 di geneticina sono stati aggiunti alle cellule BSRT7 / 5 e alle cellule NIH3T3 che esprimono il reporter della luciferasi Gli-dipendente.Le cellule sono state coltivate in un incubatore a 37°C in 5% di CO2.Le linee cellulari non sono state autenticate.Le cellule BSRT7/5 e HEp-2 sono risultate negative per il micoplasma utilizzando un MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza).Il ceppo lungo RSV (ATCC, VR-26) è stato utilizzato per i test di infezione.I virus ricombinanti, RSV-Luc, che esprime luciferasi di lucciola e RSV-M2-1-mGFP, che esprime M2-1 fuso con GFP monomerico, sono stati preparati come descritto in precedenza19.L'RSV ricombinante che esprime il gene reporter della luciferasi e codifica una sostituzione Arg-to-Lys nella posizione 151 nella proteina M2-1 (RSV-M2-1(R151K)-Luc) è stato ingegnerizzato utilizzando il vettore pACNR-rHRSV-Luc (adesione GenBank , KF713491.1) come modello per amplificare sette frammenti che coprono l'intero genoma di RSV.I frammenti sono stati assemblati insieme al frammento del vettore p15A-Chl utilizzando Gibson Assembly Master Mix (NEB, E2611).I ricombinanti RSV–M2-1(R151K)–Luc (accesso GenBank, MW039343), RSV–P–BFP (accesso GenBank, MT994243) e RSV–M2-1(R151K)–P–BFP (accesso GenBank, MT994242) sono stati salvati mediante genetica inversa e amplificato nelle cellule HEp-2 come descritto in precedenza19.Le cellule HEp-2 sono state seminate a 5 × 104 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti il ​​giorno prima e infettate con 104 unità formanti placca (PFU) di RSV-Luc in presenza di varie concentrazioni di composti.CPM (Selleck, S1146), analoghi CPM e GDC-0449 (noto anche come Vismodegib; Selleck, S1082) sono stati solubilizzati in DMSO rispettivamente a 8 mM, 8 mM e 10 mM.I composti sono stati ulteriormente diluiti in serie in DMEM contenente lo 0,25% di DMSO a concentrazioni finali comprese tra 20 μM e 0,0005 μM.Nei pozzetti di controllo delle cellule e dei virus è stato aggiunto lo 0,25% di DMSO.Le diluizioni dei composti sono state pre-incubate con sospensioni virali per 5 minuti a 37 °C prima dell'aggiunta ai monostrati cellulari in piastre da 96 pozzetti.Le piastre sono state incubate a 37 ° C per 24 ore per RSV-Luc prima dell'analisi.Le letture luminescenti sono state eseguite con un sistema Bright Glo Luciferase (Promega, E2610) e un lettore di piastre Bioteck Synergy H1.Le unità luminose relative indicano l'attività della luciferasi rispetto al valore medio di controllo (espresso in percentuale).L'IC50 è stato definito come la concentrazione del composto richiesta per ottenere una riduzione del 50% nella replicazione massima del virus.Inoltre, i test di citotossicità sono stati eseguiti con il saggio di vitalità cellulare luminescente CellTiter-Glo (Promega, G7570) dopo l'incubazione con i composti per testare la vitalità cellulare.La concentrazione citotossica del 50% (CC50) è stata definita come una riduzione del 50% della luminescenza rispetto ai pozzetti di controllo.I valori IC50 e CC50 sono stati calcolati adattando i dati a un'equazione della curva sigmoidale nel software GraphPad (GraphPad Prism 5).Isolati primari di RSV sono stati ottenuti presso la Hannover Medical School, in Germania, nel 2013 e nel 2016 da bambini con infezioni del tratto respiratorio e con una diagnosi di infezione da RSV confermata da multiplex RT-PCR23.Le cellule HEp-2 sono state inoculate con tampone nasale, fluido di lavaggio bronchiale o tampone faringeo per 4 ore a 37 °C.Dopo il passaggio a terreno fresco, le cellule sono state incubate e, se necessario, fatte passare per diversi giorni fino a quando era visibile una forte formazione di sincizi.il surnatante e le cellule sono stati raccolti e il virus associato alle cellule è stato rilasciato da tre cicli di congelamento-scongelamento in azoto liquido.I detriti cellulari sono stati rimossi dal terreno mediante centrifugazione a 1.000 g e aliquote del supernatante sono state congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80 ° C.L'RNA virale è stato isolato, retrotrascritto e i sottotipi di RSV (RSV A GA2, RSV A ON1 e RSV B) sono stati determinati mediante sequenziamento Sanger del gene della proteina G (o sequenziamento di nuova generazione del genoma virale completo) e allineati alle sequenze note trovate usando Nucleotide BLAST.Lo screening dei composti per l'antagonismo HH è stato condotto presso BPS Bioscience utilizzando il sistema reporter Gli-luciferase24.In breve, cellule NIH3T3 che esprimono luciferasi-reporter Gli-dipendenti, trasfettate stabilmente con un plasmide di espressione di luciferasi lucciola Gli-dipendente, sono state seminate in micropiastre bianche a 96 pozzetti e coltivate durante la notte.Dopo 24 ore, il mezzo è stato cambiato in Opti-MEM contenente composti diluiti e le cellule sono state incubate per altre 2 ore, seguite dall'aggiunta di 1 μg ml-1 di proteina SHH di topo ricombinante.Le cellule non trattate sono state utilizzate come controllo.Dopo il trattamento per 24 ore, le cellule sono state lisate e il test della luciferasi è stato eseguito utilizzando il sistema di test della luciferasi ONE-Step (BPS bioscience, 60690).La luminescenza è stata misurata utilizzando un luminometro (lettore di micropiastre BioTek SynergyTM 2).I saggi reporter sono stati eseguiti in triplicato per ciascuna concentrazione e l'intensità di luminescenza (L) è stata analizzata utilizzando Graphpad Prism.L'intensità della luminescenza in assenza di un composto è stata utilizzata come controllo positivo (Lp) e valutata come 100%.Il segnale registrato in assenza di cellule (Lb) è stato valutato come 0%.La percentuale di luminescenza in presenza di ciascun composto è stata calcolata secondo la seguente equazione: Luminescenza (%) = (L - Lb)/(Lp - Lb).I valori della percentuale di luminescenza per varie concentrazioni dello stesso composto sono stati quindi tracciati utilizzando l'analisi di regressione non lineare seguita dal calcolo del valore IC50.Le cellule HEp-2 sono state coltivate su vetrini coprioggetti e infettate con RSV-M2-1-mGFP o RSV-M2-1(R151K)-P-BFP a una molteplicità di infezione (MOI) di 1. A 24 ore dall'infezione, le cellule sono stati trattati con CPM o A3E alle concentrazioni indicate per 1 ora.La FISH è stata eseguita come precedentemente descritto3.In breve, le cellule sono state fissate con formaldeide al 4% in PBS (v/v) per 10 minuti a 4 °C e la biotina endogena è stata bloccata in PBS-1% BSA (p/v) integrata con streptavidina libera (4 μg ml-1 ) per 1 ora.I vetrini coprioggetto sono stati incubati in una miscela di ibridazione (2 × SSC, 300 mM NaCl e 30 mM citrato di sodio), 10% destrano (p/v), 20% formammide (v/v), 1 mg ml-1 DNA di sperma di aringa e 1 μM della sonda poli(dT) in una camera umidificata a 37 °C per 3 h.Dopo i lavaggi seriali, le sonde sono state rilevate incubando le cellule con coniugato streptavidina-Alexa Fluor 647 (8 μg ml-1) in PBS-1% BSA (p/v) e quindi colorate con anticorpo policlonale anti-N di coniglio3.Le acquisizioni di immagini z-stack di circa 50 cellule infette per condizione sono state eseguite utilizzando un microscopio WLL Leica SP8 con un obiettivo a immersione in olio 63 × e uno zoom numerico di × 2.L'etichettatura specifica dell'anticorpo N è stata utilizzata per il rilevamento automatico di IB nel software ImageJ utilizzando la funzione Analysis Particles e una soglia dimensionale a> 3 μm2.La presenza di IBAG(s) è stata quindi valutata manualmente sulla base dei segnali M2-1-mGFP (se pertinente) e poly(A) RNA.L'imaging di cellule vive e gli esperimenti FRAP sono stati eseguiti utilizzando cellule HEp-2 seminate in Ibidi μ-piatti con un fondo coprioggetto polimerico che sono stati infettati da virus ricombinanti (RSV-P-BFP, RSV-M2-1 (R151K)-P-BFP o RSV-M2-1-mGFP) ad alto MOI per 20 h a 24 h.L'acquisizione delle immagini è stata eseguita utilizzando un microscopio confocale invertito Olympus FV3000 con un obiettivo a immersione in olio 60 × e uno zoom numerico × 2,5.Le cellule sono state mantenute in una camera climatizzata (37 °C, 5% CO2) durante l'imaging.Per analizzare la dinamica IB, le immagini sono state acquisite ogni 30 s per 15-30 minuti utilizzando cellule trattate per 1 ora con 5 μM CPM o 25 μM A3E, o mock-trattate (DMSO).Immagini e video sono rappresentativi di dieci video di due esperimenti.Sono stati analizzati dieci video di 15 minuti di due esperimenti indipendenti per quantificare gli eventi di fusione e la mobilità IB.L'editing delle immagini è stato eseguito utilizzando sia il software ImageJ che Icy.Gli IB sono stati rilevati utilizzando il plug-in Spot Detector del software Icy e gli eventi di fusione sono stati conteggiati manualmente.Le velocità massime sono state ottenute utilizzando il plug-in Spot Detector con un'opzione di filtraggio delle dimensioni e il plug-in Track Manager del software Icy.Per visualizzare le dinamiche IBAG dopo il trattamento CPM e A3E, le immagini sono state acquisite ogni 6 s.Dopo 5 minuti, è stato aggiunto il composto chimico (5 μM CPM o 25 μM A3E) e l'acquisizione dell'immagine è stata eseguita per 20 minuti.I video sono rappresentativi di nove video di tre esperimenti indipendenti.L'acquisizione FRAP è stata eseguita 1 ora dopo l'aggiunta di 5 μM CPM, 25 μM A3E o DMSO (mock, controllo).Tutti gli esperimenti FRAP sono stati realizzati utilizzando le stesse impostazioni: 6 s pre-candeggina, 5 ms candeggina e 60 s post-candeggina a un frame rate di 1 immagine ogni 126 ms.Lo sbiancamento è stato eseguito in una regione circolare al 100% e all'80% di intensità del laser rispettivamente per GFP e BFP.Gli IB target erano vicini ad altri controlli IB, che sono stati utilizzati per correggere la perdita di fluorescenza dovuta al fotosbiancamento.L'intensità media della fluorescenza in funzione del tempo di ogni regione sbiancata è stata ottenuta utilizzando il software Icy.L'intensità di fondo è stata stimata misurando una regione al di fuori della cella il più lontano possibile dall'IB bersaglio.La normalizzazione delle curve di recupero è stata eseguita utilizzando easyFRAP, un'applicazione stand-alone MATLAB25.Per ogni condizione sperimentale, sono stati eseguiti due esperimenti individuali in cui sono stati analizzati 12 IB.Per ottenere le immagini FRAP visualizzate in Fig. 2, è stata acquisita un'immagine 5 s prima dello sbiancamento e le regioni di interesse sono state sbiancate con raggio laser a piena potenza per 10 ms.Le immagini sono state quindi acquisite ogni 30 s (dopo una prima immagine a 10 s).L'editing delle immagini è stato eseguito utilizzando sia il software ImageJ che Icy.Le cellule HEp-2 cresciute su vetrini coprioggetto sono state infettate con RSV-P-BFP a MOI = 1 per 24 ore ed esposte ai trattamenti indicati (DMSO, CPM o A3E) per 1 ora.Quindi, le cellule sono state fissate con PBS-4% formaldeide (v/v) per 10 minuti a temperatura ambiente e permeabilizzate con PBS contenente 1% BSA (p/v) e 0,1% Triton X-100 (v/v) per 10 minuti .Le cellule sono state incubate per 1 ora con Hoechst 33342 (1 μg ml-1) e dopo il lavaggio in PBS, i coprioggetti sono stati montati nel reagente antifade ProLong Diamond (Thermofisher).Le acquisizioni di immagini z-stack di 100 cellule per condizione da 2 esperimenti indipendenti sono state eseguite utilizzando un microscopio WLL Leica SP8 con un obiettivo a immersione in olio 63 × e uno zoom numerico di × 2.Le misurazioni della forma e dell'area degli RSV IB sono state eseguite con il software ImageJ utilizzando la funzione Analysis Particles.